基因工程知识点 《基因工程的知识点》

2018-07-16 - 基因工程

基因工程:诞生于20世纪70年代。概念:实在分子水平上进行的操作,指将多种生物体(供体)的基因或基因组提取出来,或者人工合成基因,按照人们的愿望,严密的设计,经过体外加工重组,转移到另一种生物体(受体)细胞中,使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。

基因工程知识点

三要素:供体 受体 载体。

基因工程的主要内容:1. 目的基因的获取 2. 重组体的制备 3. 重组体的转化 4、克隆鉴定 5、目的基因的表达

限制性内切酶:是一种能够识别双链DNA 分子中的某种特定核酸序列(4-8bp )并由此处切割双链的核酸内切酶。 1、来源:原核生物 2、性质:在核酸分子链的内部制造切口 3、功能:自身保护作用 (R/M体系:保护自身的DNA 不受限制,破坏外源的DNA 使之迅速讲解)

基因工程知识点

影响限制酶活性的主要因素:1、DNA 的纯度 2、DNA 的甲基化程度 3、温度 4、缓冲溶液 5、DNA 的分子结构

Klenow 片段:E.coli DNA 聚合酶Ⅰ经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C 末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA 聚合酶I 的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性,但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。 功能:1、3ˊ断的补平;2、DNA 3ˊ末端标记;

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3、cDNA 第二链的合成。

平齐末端DNA 的连接方法:1、同聚物加尾法 2、衔接物法;3、接头连接发。

双酶切相对单酶切的优点:可保证插入外源片段的方向,防止载体自连,提高重组率。 星号活性:在非理想的条件下,内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列,这一现象称星号活性。

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部分酶切:指选用的核酸内切酶对其在DNA 分子上的全部识别序列进行不完全的切割。 发生部分酶切的原因:底物DNA 纯度低;识别序列甲基化;酶用量不足;反应缓冲液和温度不适宜。

碱性磷酸酶和S1磷酸酶的功能:碱性磷酸酶主要是脱磷酸作用,其产物具有5-OH 末端,这种功能使它在DNA 分子克隆实验中发挥着重要作用,利用该酶可以有效防止粘性末端分子自连。

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S1核酸酶:是一种高度单链特异的核酸内切酶,可降解单链DNA 或RNA ,不仅能催化RNA 和单链DNA 分子降解成为5单核苷酸,而且它也能作用于双链核苷酸单链区。功能:测定杂种核酸分子的杂交程度,给RNA 分子定位,测定真核生物基因中间隔子序列的位置,探测双螺旋的DNA 区域,从限制性内切酶产生的粘性末端中移去单位链突出序列以及打开双链cDNA 合成期间形成的发夹结构。

载体:在基因工程操作中,把能携带外源DNA 进入受体细胞的DNA 分子叫载体。

基因工程对载体的要求:1、在宿主细胞能独立复制 2、有选择性标记 3、有一段多克隆位点 4、分子量小、拷贝数多 5、容易从宿主细胞中分离纯化

质粒载体必须具备的条件:1、具有复制起点 2、具有抗菌素抗性基因 3、若干限制酶的单一位点 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数

质粒的分离:通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠(SDS )来促使大肠杆菌的裂解。1、氯化铯密度梯度离心法 2、碱变性法 3、微量碱变性法

质粒载体的基本构型:1、共价闭合环状DNA 2、开环DNA 3、线性DNA

表达型质粒载体:主要使外源基因表达出蛋白质产物,如果在大肠杆菌里表达,必须使所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录和翻译之下。

穿梭质粒载体:人工构建的具有两种不同重复起点和选择标记,可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

大肠杆菌表达载体的操纵元件:阻遏基因I ,操纵基因O ,启动基因P ,核糖体结合位序列,转录终止信号。

质粒载体不稳定的因素:1、结构的不稳定性:DNA 的插入,缺失和重排都会造成质粒载体结构不稳定。2、分离的不稳定:在寄主菌细胞分裂的过程中,有一个细胞没有获得质粒拷贝,并最终繁殖成无质粒的优势群体。

影响质粒载体稳定性的主要因素:1、新陈代谢负荷 a 、复制负荷 b 、转录和翻译负荷 2、质粒载体的拷贝数 3、寄主菌的重组体系

PCR 的原理和特点:原理:类似于DNA 的体内复制,首先待扩增DNA 模板加热变性解链,随之将反应混合冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火,再将温度升高,使退火引物在DNA 聚合酶作用下得以延伸,这种变性、复性、延伸的过程,就是一个PCR 循环,PCR 就是在合适条件下的这种循环的不断重复。特点:1、灵敏度高 2、简便快捷 3、对标本的纯度要求低

反向PCR:是用反向互补引物来扩增两引物以外的DNA 片段,对某个已知DNA 片段两侧的位置序列进行扩增。

RT-PCR :是以反转录的cDNA 做模板进行的PCR 反应,用于测定基因表达的强度和鉴定已知序列是否发生突变,呈现mRNA 多态性,克隆mRNA 5`和3`末端序列,以及从非常少量的mRNA 样品构建大容量的cDNA 文库。

多重PCR:在一个反应体系中,使用一对以上引物的PCR 反应,称为多重PCR 。

荧光定量PCR :通过荧光染料火荧光标记的特异性探针,对PCR 产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件,可以对结果进行分析、计算待测样品的初始模板量。 引物设计的基本原则:1、引物一般在18-30Bp 为宜。

2、避免引物内部出现出现二级结构、回文结构。 3、GC 和AT 碱基均匀分布 4、避免出现两引物碱基末端互补 5、引物3`末端碱基一般应与DNA 严格配对 6、引物碱基序列不能与非扩增区有同源性。

PCR 产物不正常的原因:1、没有PCR 产物 a/TAQ酶失活 b、引物使用错误 c、是否完全解链。2、没有特异性条带 a/退火温度过低,退货延伸时间过长 b/循环次数过多 c/引物与TAQ 酶的浓度过高 d/Mg离子浓度过高 3、没有目的条带,出现片状。a/循环次数过多 b/TAQ酶浓度过高 c、引物特异性不强 d/Mg离子浓度过高

目的基因:那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段。 基因文库:

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